文献解读：不同施磷对 3 种羽扇豆生理响应和根际细菌群落多样性的影响

摘 要：

白羽扇豆 （Lupinus albus） 通过产生可以分泌羧酸盐并增强磷酸酶活性的簇根来动员难以吸收的磷 （P）。蓝羽扇豆 （L. angustifolius） 和黄羽扇豆 （L. luteus） 与白羽扇豆属于同一豆科植物，本研究调查了蓝色和黄色羽扇豆在 P 缺乏下是否能引发适应策略。本盆栽试验选用3种羽扇豆物种，分别进行-P、+Pi （NaH₂PO₄）和+Po（Phytate）处理。两个月后，测定了不同处理下羽扇豆的生物量和磷分配、Hedley-P分级、分泌物组成和根际细菌多样性。结果表明：-P和+Po处理下，白羽扇豆积累了较高的磷含量，而黄羽扇豆在+Po和+Pi处理下磷含量相近。此外，在-P处理下，白羽扇豆有较高的柠檬酸分泌、碱性磷酸酶和植酸酶活性，在+Po处理下，植酸酶和β-葡萄糖苷酶活性升高。特别是，在+Po处理下，白色和黄色羽扇豆的根际中同时存在有助于植酸活化的Segetibacter、Granulicell、Candidatus_Methylacidiphilum和Bryobacter属。在+Po处理下，白色和黄色羽扇豆的根际中同时存在对植酸盐活化有贡献的氨基酸。本研究阐明了羽扇豆在适应磷缺乏中的多方面生理反应，并为根际细菌在植酸动员中的作用提供了新的见解。

研究背景：

磷（P）是植物必需元素，在各种生物化学循环中起着至关重要的作用，是核酸和细胞膜的重要组成部分。此外，磷可以限制作物生长和生产力，因为它倾向于被土壤矿物颗粒固定，最终随着时间的推移转化为遗留的磷形式。通常情况下，作物只吸收了13%的无机磷肥（Pi） 。为了高产而持续增加磷肥的使用导致土壤中残余磷水平升高。

各种磷组分的分布和转化受土壤母质和土壤发育的影响。不同形态磷肥的施用直接影响土壤中活性磷的百分比。有机磷（Po）一般占土壤全磷含量的35-65%，有机磷的比例受土壤性质和环境条件的影响。然而，由于有机磷在不同pH条件下吸附在土壤胶体上并与金属离子螯合，很大一部分仍无法被植物获取，导致有机磷的利用效率较低。有机磷需要通过酶的作用转化为磷，才能被植物利用。植酸盐是一种特别大量的有机磷，在细胞外植酸酶的帮助下矿化，主要来源于微生物，包括细菌、真菌和酵母。假单胞菌、解淀粉芽孢杆菌和伯克氏菌等菌株具有较高的植酸酶活性，有助于增强磷酸矿化。

土壤有机磷矿化受植物-土壤-微生物动态相互作用中微生物活动的强烈影响。这种相互作用在根际土壤中尤为明显，根际土壤是一个高度活跃的区域，由直接附着在根上的土壤团聚体组成。植物与微生物之间的共生交换建立了一个和谐的循环：首先，微生物促进矿物元素的释放，促进植物生长。同时，根系分泌物作为微生物群落的碳和能量来源。此外，有机磷作为一种共享资源，在植物和根际细菌之间形成了独特的竞争关系。根际细菌的多样性，特别是与磷利用有关的细菌的多样性，受到各种肥料施用和植物种类等因素的复杂影响。

土壤磷获取的差异源于不同作物为优化磷吸收而采用的不同根系策略，这甚至可以在给定物种的不同基因型中观察到。白羽扇豆（Lupinus albus），蓝羽扇豆（L. angustifolius）和黄羽扇豆（L. luteus）属于同一个豆科属。白羽扇豆是研究缺磷环境下植物适应机制的重要模式植物，因为它可以在次生根上发育致密的小根，以扩大根的吸收表面积。此外，大量研究从生理学角度证实了丛集根中有机酸分泌的增强和磷酸酶活性的增加。与可以产生块状根或蛋白质样根的白羽扇豆相反，黄羽扇豆具有较长的侧根。在缺磷情况下，黄羽扇豆明显可见簇状根系结构，而蓝羽扇豆即使在极度缺磷的情况下也无法形成这种根系结构。虽然在缺磷水培条件下，3种不同种类的根际细菌在吸收和渗出方面存在差异，但为了验证适应策略的实际效果，阐明根际细菌与土壤磷矿化之间的相互作用，还需要进行全面的研究。

本研究通过培养3种不同种类的羽扇豆，研究不同磷处理下根际土壤中生物量和磷分配的差异，检测根际土壤中磷酸酶活性和羧酸盐浓度，探讨根际土壤细菌群落与植酸矿化的关系。假设：1）不同磷处理下，3种羽扇豆植物表现出不同的形态响应，如根构型和根冠比的变化；2）缺磷胁迫下，能形成丛枝根的白羽扇豆分泌更多羧酸盐，磷酸酶活性更高；3）根际土壤细菌群落的多样性影响植酸矿化，从而影响羽扇豆中磷的积累。

研究方法：

本研究通过培养3种不同种类的羽扇豆，分别为蓝羽扇豆 （L. angustifolius） 、黄羽扇豆 （L. luteus） 与白羽扇豆（Lupinus albus）。设置了三种P处理：无P条件（-P）和P添加条件，包括无机P （+Pi）或有机P （+Po），分别添加100 mg P kg ^{- 1}的NaH₂PO₄或植酸盐。试验设3个重复，每盆培养2株羽扇豆。2个月后，收集了3种羽扇豆植物样品、根系样品和根际土壤样品，测定了不同处理下羽扇豆的生物量和磷分配、Hedley-P分级、分泌物组成和根际细菌多样性。

主要研究结果：

1.缺磷条件下，白羽扇豆对磷的吸收较好；黄羽扇豆对植酸盐的利用率较高

为比较不同磷处理对白、蓝、黄羽扇豆生物量分配的影响，将羽扇豆分为茎部和根部，测定其干重。无论磷处理如何，白羽扇豆的总生物量最高，而蓝羽扇豆和黄羽扇豆的总生物量较低（图1）。磷处理下，白羽扇豆总生物量为2.68 g， +Pi处理下为2.90 g， +Po处理下为2.72 g。不同磷处理下，白羽扇豆的根、梢质量均无显著差异（P ≤ 0.05，图1）。此外，蓝羽扇豆的总生物量在-P、+Pi和+Po处理下分别达到0.65 g、1.07 g和1.07 g。其中，加磷处理（+Pi和+Po处理）蓝羽扇豆地上部生物量均高于加磷处理。+Po处理下蓝羽扇豆根系生物量分别是-P和+Pi处理下的1.10倍和1.74倍。

图1  不同施磷条件下3种羽扇豆植物根、地上部生物量的比较。

  与蓝色和黄色羽扇豆相比，+Pi处理下白色羽扇豆的总磷含量最高。3个施磷处理中，茎部磷含量无显著差异，但以Pi培养的根磷含量最高；P处理最低（P ≤ 0.05，图2）。对于蓝羽扇豆，茎部P含量差异显著：+Pi> +Po>-P处理，+Pi处理的根P含量高于-P或+Po处理。磷含量以磷添加的黄羽扇豆幼苗最高。实际上，它比-P和+Po处理分别高出54%和16% （P ≤ 0.05，图2）。比较了不同施磷处理下3种羽扇豆植物对磷的吸收变化（收获后全株和种子对磷的吸收差异）。在不同的施磷处理下，白羽扇豆从土壤中获得的磷量最大，蓝羽扇豆最少。

图2  不同施磷条件下3种羽扇豆植物根、地上部磷含量的比较。

2.不同施磷处理下土壤pH和Hedley-P分级的变化

为阐明不同类型磷形态对土壤pH值的影响，测定了3种羽扇豆植物收获期根际土壤pH值。特别有趣的是，不同羽扇豆植物的根际pH值呈现出一致的规律：土壤pH值在-P处理下最高（6.88 ~ 7.08），其次是+Pi处理（6.42 ~ 6.55）；Po处理后最低（5.70 ~ 5.85）。施用不同磷肥后，3种植物根际pH值差异显著（P ≤ 0.05，表1）。

为了评价不同磷处理下土壤P组分的转化，将土壤P分为树脂P、NaHCO₃-Pi、NaHCO₃-Po、NaOH-Pi、NaOH-Po、HCl-P和残余P 7个组分。不同条件下根际磷组分浓度如图3所示。2个月后，羽扇豆根际土壤全磷含量均较种植前的原土有所下降。总体而言，根际中各磷组分的含量顺序为：NaOH-Pi>HCl-P>残余>NaOH-Po> NaHCO₃-Po>树脂-P。磷处理下，与原土相比，白、蓝、黄三种羽扇豆根际全磷含量均有所降低。

图3  磷、+P和+Po处理下原土、白、蓝、黄羽扇豆根际中磷含量的变化

本研究定义了三个P组分：ResinP、NaHCO₃-Pi和NaHCO₃-Po为不稳定P （LP）；NaOH-Pi和NaOH-Po为中等不稳定P （MP）；HCl-P和残余P为稳定P （SP）。与磷处理相比，两种+磷处理土壤中有机磷的比例最高，其次是SP， LP占土壤总磷含量的比例最低（表2）。与磷和+Po处理相比，添加磷后土壤中LP含量显著增加。P处理下各处理中MP组分的浓度均显著低于+Pi和+Po处理。不同磷处理下，白色和黄色羽扇豆的SP浓度差异不显著，而蓝色羽扇豆的SP浓度在+Pi处理下显著高于-P处理。在+Pi处理下，无机磷以LP和MP形式储存（不稳定P和中等不稳定P形式的百分比增加）。在+Po处理下，植酸在与羽扇豆一起培养后最终以稳定形态（稳定P形态的百分比增加）储存在土壤中。

表2 在-P、+Pi和+Po条件下3种羽扇豆根际中稳定磷、中等稳定磷和不稳定磷的含量

3.三种豆属植物的根系发育出不同的生理缺磷适应策略   

为了研究不同磷处理对羽扇豆根际分泌物的影响，采用离子色谱法测定了柠檬酸盐和苹果酸盐浓度。对白羽扇豆而言，-P处理的柠檬酸盐浓度是+Pi处理的23.78倍，是+Po处理的9.57倍。不同磷处理间苹果酸盐浓度无显著差异（图4）。在不同磷处理下，苹果酸浓度（4.73 ~ 3.59 nmol g⁻¹）显著高于柠檬酸浓度（0.94 ~ 1.78 nmol g⁻¹）。在-P处理下，蓝羽扇豆分泌柠檬酸显著高于+Pi处理。+Po处理下的浓度介于两者之间。对于黄羽扇豆，缺磷处理的根际柠檬酸盐浓度为1.00 nmol g⁻¹，Pi处理的浓度为0.34 nmol g⁻¹，Po处理的浓度为0.70 nmol g⁻¹。

为了证实不同磷处理对根际中不同酶活性的影响，我们利用特定底物测定了ACPase、ALPase、β-Glu、Chi和PHYase的活性。对于蓝羽扇豆，-P处理下ACPase活性显著高于+P处理（图5）。不同磷处理下，三种羽扇豆植物的ALPase活性结果相似：-P> +Po> +Pi处理程度不同。对于Chi活性，在不同处理或不同物种之间没有发现差异。就白羽扇豆而言，+Po处理下β-Glu活性高于-P和+Pi处理。对于PHYase活性。与其他处理相比，+Pi处理下的白羽扇豆水平较低。P处理下蓝羽扇豆表现出更高的活性。

图4  不同施磷条件下三种羽扇豆根际有机酸浓度的变化

 图5  不同施磷条件下3种羽扇豆根际土壤酸性磷酸酶（ACPase）、碱性磷酸酶（ALPase）、几丁质酶（Chi）、β-葡萄糖苷酶（β-Glu）和植酸酶（PHYase）的酶活性

4. 黄羽扇豆根际土壤丰富度最高

通过usearch软件分析，我们得到了在ASV水平为0.97时反映羽扇豆根际土壤细菌群落α多样性的指标。在-P和+Pi处理下，白羽扇豆土壤的α多样性值最高。蓝羽扇豆次之；黄苹最低。相比之下，植酸培养后，黄羽扇豆的细菌群落丰富度、均匀度和多样性大于蓝羽扇豆和白羽扇豆（表3）。

表3 -P、+Pi和+Po条件下3种羽扇豆根际细菌群落α多样性

. 变形菌门和拟杆菌门是两个相对丰富的门

利用Bray-Curtis距离，采用主坐标分析法（PCoA）直观地比较了不同施磷处理的根际细菌群落组成。两个PCoA成分分别解释了46%和19%的方差。如图6所示，不同的P处理导致三种羽扇豆物种之间的细菌组成显著不同。这一发现强调了施磷量对细菌群落组成的影响大于羽扇豆物种。特别是，从PCoA2轴上看，与+Pi处理相比，-P和+Po处理的聚类倾向显著增强。因此，3种羽扇豆根际细菌群落组成在+Pi处理下存在显著差异。

在门水平上，变形菌门（Proteobacteria）和拟杆菌门（Bacteroidetes）是两个最丰富的门，共占总细菌群落的66%（蓝羽扇豆+Po处理）至78%（黄羽扇豆-P处理）（图6）。无论何种卢平，Proteobacteria和Bacteroidetes的总丰度在-P处理下最高，其次是+Pi处理，+Po处理下最低。酸性菌群和放线菌群在+Po处理下丰度最高，在-P处理下最少。磷处理显著高于+P处理，而黄羽扇豆根际中Verrucomicrobia门丰度显著高于+P处理。在属水平上，3种间根际土壤以Flavisolibacter、Sphingomonas、Flavobacterium、Massilia、Rhodanobacter和Mucilaginibacter 6个属为主。它们的相对丰度在不同处理下发生变化。不同的羽扇豆品种，Flavisolibacter在-P处理下丰度最高，其次是+Pi和+Po处理。磷处理显著提高了白羽扇豆和蓝羽扇豆根际鞘单胞菌的丰度。其中，磷处理下黄羽扇豆根际土壤鞘单胞菌丰度为8%；而在+Po处理下为6%。事实上，在+Pi处理下，它的丰度最低，为2%。3种羽扇豆根际土壤黄杆菌丰度表现为-P> +Pi> +Po处理的一致性。

在黄羽扇豆根际中，短单胞菌属和双胞菌属的相对丰度在缺磷处理下高于其他两个处理。培养后，根际中Massilia属和Chthoniobacter属的丰度较高。在+Po处理下，Mucilaginibacter属和Verrucomicrobia_Incertae_ Sedis类的丰度高于-P或+Pi处理（图7）。

图6 不同磷处理下3种羽扇豆根际土壤细菌群落的比较及组成

图7 不同施磷条件下三种羽扇豆根际细菌群落组成的LEfSe分析。

4. 不同处理下根际细菌群落的RDA及代谢途径预测

为了反映测量的环境因子对根际细菌多样性的解释，进行了冗余分析（RDA）。很明显，根际pH、LP和MP对细菌群落组成有显著影响，其次是ALPase、PHYase和柠檬酸盐。ACPase、β-Glu、Chi、SP和苹果酸盐的影响较小（图8）。与+Po处理相比，在-P和+Pi处理下，与氨基糖和核苷酸糖代谢、半胱氨酸和蛋氨酸代谢以及淀粉和蔗糖代谢相关的途径明显富集。与此相反，+Po处理丰富了脂肪酸降解、苯丙氨酸代谢和赖氨酸降解途径。选择植酸培养黄羽扇豆根际细菌生物标志物为Candidatus_Methylacidiphilum属（LDA=2.33, P = 0.05）和Mucilaginibacter属（LDA=2.66, P = 0.03），以及Acidobacteria_Subgroup_3目（LDA=2.21, P = 0.03）。此外，这三种根际细菌的丰度与土壤LP和MP组分的浓度成反比。

图8 冗余分析（RDA）揭示了典型环境因子对响应变量（根际细菌群落）的贡献以及不同处理条件下根际细菌的功能预测

5.结论：

各施磷处理下，白羽扇豆和黄羽扇豆的生长保持稳定，而蓝羽扇豆的生长受到显著抑制。在磷不足的条件下，白羽扇豆通过增加柠檬酸盐分泌和酶活性来激活不溶性磷，并增加根际中增磷细菌的丰度。此外，在植酸补充条件下，根际中伯克霍尔德菌和假单胞菌的富集与植酸酶活性的提高有关。+Po处理下黄羽扇豆根际细菌丰富度较高。本研究证实了优势根际细菌对植酸矿化的贡献。本研究系统地阐明了磷缺乏和植酸补充对3种羽扇豆属植物的生理反应和根际细菌群落的差异，重点研究了根际-羽扇豆-细菌的相互作用。研究结果表明，有必要进一步研究白羽扇豆和黄羽扇豆中在根际对植酸盐的动员作用。